Cosimo dei Medici prese il posto del defunto Alessandro nel governo di Firenze e, desideroso di impossessarsi dei feudi e dei beni di Margarita e del defunto Alessandro, la chiese in sposa. Non vi riuscì perché il papa Paolo III accarezzava l'idea di un'unione tra la giovane vedova e suo nipote, il quindicenne Ottavio Farnese. Carlo V per motivi politici fu d'accordo con il pontefice; la quindicenne Margarita accettò la decisione paterna, abbandonò Firenze nel luglio del 1537, dirigendosi a Prato in attesa del nuovo matrimonio. Qui, essendo duchessa di Penne e Signora delle terre del regno di Napoli e del Lazio (ereditate dopo la morte di Alessandro), emanò i primi statuti evidenziando saggezza e disponibilità. Margarita, di nuovo sposata e divenuta anche duchessa di Castro, non volle consumare il matrimonio, poi fu convinta dalla mediazione di S.Ignazio da Loyola e dal pontifice; dette alla luce due gemelli (uno poi morì).
Solo quando Ottavio nel 1541 fu impegnato con Carlo V in imprese di guerra (Algeri), Margarita cominciò ad apprezzarlo ed a difendere gli interessi dei Farnese. Nel 1545 il ducato di Parma e Piacenza (a cui Francia, Spagna e Santa Sede erano interessati) fu conferito a suo suocero Pier Luigi (figlio di Paolo III) grazie ad una bolla papale malgrado Margarita avesse combattuto affinché tale feudo fosse assegnato a suo marito Ottavio, i cui interessi difendeva ormai a spada tratta anche davanti a Carlo V ed a Paolo III ormai in disaccordo per motivi politici.
Nel 1547 morì assassinato Pier Luigi (mandante Ferrante Gonzaga, governatore imperiale di Milano); Piacenza fu occupata dalle truppe imperiali e quindi sottratta ad Ottavio e a Margarita che contestarono. L'imperatore, per zittirli, minacciò di toglier loro anche Parma al fine di favorire l'espansionismo del ducato milanese. Paolo III, per contrastare Carlo V, si appoggiò al re di Francia e, per risolvere la questione del ducato di Parma e Piacenza, decise di sottrarlo ai Farnese e di incamerarlo nello Stato della Santa Sede. Ottavio non accettò la decisione del nonno-pontefice e marciò su Parma e Piacenza nel tentativo di patteggiare con il Gonzaga. Margarita da ottima politicante ricucì lo strappo con Paolo III, il quale prima di morire riconobbe al nipote la restituzione di Parma ad Ottavio. Il nuovo pontefice, Giulio III, ridette quindi Parma ad Ottavio mentre Piacenza rimaneva in possesso degli imperiali. Margarita, con i suoi numerosi titoli nobiliari (Penne, Camerino, Castro, Parma e Piacenza), fu oggetto di molte gelosie e maldicenze anche per il suo fare poco femminile.
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