Sotto la famiglia Cesi fu redatto il nuovo statuto. Fu il principe Federico Cesi, il Linceo, a eleggere il castello sampolese sede dell'Accademia dei Lincei da lui fondata nel 1603 e alla quale aderì anche Galileo Galilei. Da qui il grande botanico partiva per ascendere al Pratone (detto per questo Anfiteatro dei Lincei) ove compiere i suoi studi scientifici.
L'impulso dei Cesi fu in crescendo fino al 1656. Poi la popolazione fu colpita nel 1656 dalla peste che la decimò riducendola a soli 377 abitanti. Desiderosi di ripopolare il paese, i Cesi invitarono a stabilirsi a San Polo svariate famiglie dei paesi limitrofi. Il 2 maggio 1678 i Cesi vendettero il feudo ai Borghese. Nel 1700, non interessandosene, i Borghese dettero in affitto il castello e le terre a Pietro Trusiani. Dal 1700 in poi si trova menzione dell'aggiunta al nome del paese San Polo la parola dei Cavalieri. Il 13 febbraio 1810 i Borghese affittarono per altri 99 anni il castello a Nicola Trusiani. Nella campagna di Russia a seguito di Napoleone parteciparono anche tre giovani sampolesi. Con la caduta di Bonaparte e la Restaurazione, Pio VII abolì gli statuti locali dividendo lo Stato pontificio in 17 delegazioni; San Polo fu messo sotto il Governo di Tivoli sotto cui rimase fino al 1870.
Nel 1849 vi passò Giuseppe Garibaldi con Anita e molti volontari in fuga da Roma dopo la caduta della Repubblica Romana. L'eroe dei due Mondi, per sviare l'attenzione degli eserciti che lo inseguivano, fece finta da Tivoli di proseguire verso Arsoli ma decise di prendere la strada di San Polo passando poi da Palombara, Mentana e Monterotondo dirigendosi verso la provincia reatina e la Romagna. San Polo fu anche teatro di movimenti garibaldini nel 1867 nel corso della Campagna dell'Agro Romano per la liberazione di Roma.
Il 22 novembre 1863 fu fondato il concerto bandistico di San Polo il cui primo direttore fu il maestro Giuseppe Fantoni di Cento.
Nel 1871 anche a San Polo avvennero le prime elezioni. Sotto l'aumento demografico le cisterne per l'acqua non furono più sufficienti per cui si costruì il primo acquedotto: "Riu vecchio in piazza della Vittoria". Ad esso se ne aggiunse un secondo nel 1900 giacchè anche Marcellina, allora frazione di San Polo, era carente d'acqua. Furono acquistate dal Comune di Roccagiovine due sorgenti ma ciò non bastò per pacificare gli animi tra San polo e la frazione, che il 5 luglio 1909 divenne Comune autonomo.
Sempre agli inizi del Novecento si segnalano la fondazione della Gazzetta di San Polo (1910), la realizzazione della strada carrozzabile Roma-San Polo (1920) e l'illuminazione elettrica del paese (in occasione del Venerdì Santo del 1922) operata dalla società Fiamma.
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