Operando un salto di alcuni secoli, vediamo l'insediamento, all'interno dei piani nobiliari della Villa, di una comunità monastica e l'erezione della Chiesa di S. Maria in Villa. Tale denominazione è ovviamente in stretta relazione al luogo in cui sorse tale costruzione. Si ignora la data in cui fu edificata ma sappiamo che già esisteva nel 1354 se è da credere a ciò che è riportato in "Cronaca della Vita di Cola di Rienzo" dell'Anonimo Romano. Vi si legge che in quell'anno il tribuno romano si accampò nei pressi della chiesa ("allocao lo tribuno all'oste de Santa Maria della Villa") durante l'attacco a Palestrina. Si ipotizza comunque che la costruzione della chiesa risalirebbe ai primi secoli del Cristianesimo; ad essa annessi il convento (costituito da tre locali voltate a crociera), il chiostro (l'ex aula con le due esedre), il refettorio. Una comunità di monaci si sarebbe infatti stabilita qui probabilmente già a partire dal Medioevo. Per la sua costruzione, come si è detto, fu
riutilizzato il materiale dell'antica Villa Imperiale.
La chiesa è ad unica navata scandita da volte a crociera. La decorazione dell'abside, commissionata alla fine del XVI secolo dall'Arcivescovo ragusino Paolo Alberi (stretto amico della potente famiglia dei Colonna, signori di Palestrina), presenta stucchi con motivi a grottesca. Essi, che forse inizialmente presentavano un rivestimento in foglia d'oro, fanno da cornice ad un affresco, raffigurante la Madonna in trono con Bambino, riemerso nel 2008 durante le indagini di studio.
L'affresco quattrocentesco (ritenuto miracoloso richiamando molti pellegrini) forse in origine si estendeva sull'intera superficie del catino absidale. Venne coperto da una decorazione in stucco che risparmiò (proprio per la citata sua caratteristica miracolosa) solamente la Madonna con il Bambino. Bellissimo l'affresco in cui è dipinta la Vergine assisa in trono con in braccio il Bambino; quattro angeli, alle sue spalle, sostengono un drappo ben decorato.
La scena, in alto, è dominata dalla colomba, simbolo dello Spirito Santo.
Da saggi eseguiti sulla decorazione in stucco è stato accertato che su tutte le decorazioni aggettanti della chiesa era applicata una sottile foglia d'oro. Una commissione di elevato valore artistico, oltre che economico. La scoperta dell'affresco mariano è avvenuta in maniera casuale ed è una conquista recente in seguito ai lavori di ristrutturazione e agli studi intrapresi dal Comitato di Quartiere "Villa di Adriano". Per evitare il danneggiamento della pala (del 1870), collocata sopra l'altare della chiesa, ne era stata decisa la rimozione temporanea. Fu così che si trovò l'affresco mariano, citato in tutte le fonti che menzionavano questa Chiesa e di cui si era perduta traccia.
La suddetta tela, di cui è autore un pittore romano incaricato della sua realizzazione dal vescovo Amat, ha attualmente trovato collocamento sulla parete nord della chiesa.
L'altare, che costituisce l'elemento più antico della chiesa, è stato ricavato da un pezzo di trabeazione romana, decorato a ovuli e foglie lanceolate su ambo i lati, mentre sul frontale spicca una decorazione a tessere musive e inserti di pasta vitrea, tipica dello stile dei Marmorari Romani o Cosmatesco, la cui antichità conferma la fondazione e la ricchezza della chiesa già in pieno Medioevo. Sembra tuttavia che la decorazione sia dell'altare che della chiesa risalgano allo stesso periodo in cui si provvide a ristrutturare la cattedrale di Palestrina che fu inaugurata nel 1117 dal pontefice Pasquale II (al secolo Raniero Ranieri). La chiesa infine fu utilizzata come lazzaretto in occasione della peste del 1656/57.
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