Una tradizione leggendaria attribuisce la fondazione della cattedrale all'Imperatore Costantino (306-337) il quale dopo l'editto di Milano, convertito al cristianesimo, concesse al culto cristiano le basiliche pagane. Secondo un'altra leggenda, invece, è da assegnare al pontefice tiburtino Simplicio (468-483) il merito di una vasta attività edilizia sacra che portò alla costruzione di varie chiese tiburtine come S.Pietro alla Carità, S.Stefano, S.Silvestro, S.Maria Maggiore e la Cattedrale di S.Lorenzo. Papa Simplicio, divenuto pontefice sette anni dopo Leone I Magno,
continuò l'azione di guida e difesa del gregge di Cristo durante i difficili anni delle invasioni barbariche, delle eresie e delle incomprensioni con le chiese orientali. Sicuramente la prima notizia scritta dell'esistenza della chiesa si ha nella biografia di papa Leone III (791-816), che l'arricchì di doni. La chiesa fu edificata sopra le rovine dell'antico Foro tiburtino, riutilizzando il sito dell'Aula Romana della quale è stata conservata l'abside, ancora visibile all'esterno della basilica attuale.
Questa zona, inserita dunque nella Regio Foro (come si desume da un documento del 978), è il polo religioso della Tivoli medievale, in prossimità del tratto urbano della via Tiburtina (via San Valerio), in comunicazione diretta con il polo politico (nell'attuale piazza Palatina) e, attraverso la via del Duomo, in comunicazione con il polo commerciale sorto nella piazza dei Selci. Parecchi secoli dopo, la vecchia basilica fu ricostruita una prima volta fra la fine dell'XI e gli inizi del XII sec.: la chiesa venne completamente ricostruita (tracce del primo edificio si conservano al disotto dell'antica basilica e dietro l'abside), ad essa fu affiancato un massiccio campanile romanico scandito da due bifore per lato e posto presso l'antico arco d'entrata del Foro. La nuova costruzione si presentava come un'ampia basilica a tre navate con presbiterio sopraelevato dotato di un altare in marmo sormontato da un ciborio a forma di piramide.
Una ben più radicale opera di ricostruzione, nonostante la disapprovazione dei fedeli e di buona parte del clero, fu fatta nel 1635, con la spesa di 50 mila scudi, dal Cardinale milanese Giulio Roma, nominato Vescovo di Tivoli nel 1634. La nuova chiesa fu portata a termine nell'arco di cinque anni e consacrata il 1 febbraio 1641, anche se la facciata e il portico vennero completati solo nel 1650, due anni prima della morte del Cardinale Roma.
La planimetria della chiesa si rifà al prototipo della chiesa del Gesù di Roma, consacrata nel 1584, che fissò la tipologia dell'edificio sacro a navata unica con cappelle laterali. La zona presbiteriale fu abbassata ed eliminati il coro rettangolare antistante al presbiterio e la vasca battesimale, dietro l'altare maggiore furono inseriti un coro ligneo, gli stalli dei sacerdoti e la cattedra del vescovo. Dell'antica basilica il cardinale conservò però le opere più pregevoli; in particolare il campanile romanico, alcuni monumenti funebri all'interno della chiesa, come quelli dei vescovi Angelo Lupo e Angelo Leonini.
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